Warunki termocyklingu były następujące: 40 cykli po 30 sekund w 94 ° C, 30 sekund w 60 ° C i 45 sekund w 72 ° C. Wyniki
Ryc. 1. Ryc. 1. Transmisyjna mikroskopia elektronowa plemników wytryskujących z Probanda. Plemniki z dobrze ukształtowanymi jądrami (N) i akrosomami (A) są ewidentne wśród innych plemników, które są niedojrzałe i są osadzone w resztach cytoplazmatycznych lub nekrotycznych z uszkodzonymi błonami.
Analiza wielu próbek plemników od pacjenta wykazała prawidłową liczbę plemników, od 54 do 66 milionów plemników na mililitr, przy średniej 330 milionów plemników na ejakulat. Całkowita ruchliwość progresywna (suma szybkich i wolnych) została nieznacznie zmniejszona, od 28 do 34% nasienia, a odsetek morfologicznie prawidłowych postaci wynosił około 30%. Oprócz zmniejszenia ruchliwości plemników (łagodna astenozoospermia), wszystkie inne charakterystyki plemników mieściły się w normalnym zakresie, zgodnie z wytycznymi WHO.10 Normalny fenotyp plemników potwierdzono za pomocą mikroskopii elektronowej (Figura 1), która ujawniła dobrze ukształtowane jądra, skrócona chromatyna, ogony o normalnej strukturze i regularne aksonemy. Plemniki z nieprawidłowymi cechami morfologicznymi wykazywały strukturalne anomalie typowe dla niedojrzałości: zmienione formowanie acrosomalne lub jądrowe, nieskondensowana chromatyna i reszty cytoplazmatyczne. Niewielki procent plemników miał cechy nekrotyczne, takie jak popękane błony plazmatyczne, przereagowane lub brakujące akrosomy i zakłócona chromatyna (Figura 1).
Analiza FISH próbek plemników wykazała częstość disomii chromosomu 18 0,15% (zakres od 0,13 do 0,17), która była podobna do tej u płodnych mężczyzn (średnia, 0,12%, zakres od 0,04 do 0,19) .11 Szybkość diploidii u pacjent wynosił 0,26% (zakres od 0,19 do 0,31) i nie różnił się istotnie od stanu płodnych mężczyzn (średnia, 0,28%, zakres od 0,17 do 0,36), podczas gdy częstość występowania disomii płciowo-chromosomowej wynosiła 0,42% (zakres, 0,32 do 0,49), który był nieco wyższy niż u płodnych mężczyzn (0,23%, zakres od 0,14 do 0,38). 11 Kariotyp pacjenta był prawidłowy (46, XY).
Rycina 2. Rycina 2. Azoospermia Factor Locus (AZF) ludzkiego chromosomu Y i usunięty region w Proband. Panel A pokazuje AZF, w tym jego trzy regiony. W szczególności dla AZFa, pokazane w skali, są specyficzne dla ubikwityny peptydaza 9, połączony przez Y gen USP9Y, DEAD (Asp-Glu-Ala-Asp) 3 polipeptyd 3, przyłączony przez Y genu DDX3Y i miejsca znakowane sekwencją. PAR oznacza receptor aktywowany proteazą, region Yp p chromosomu Y i region q q. Znaki kreskowania wskazują przerwę na schemacie. Sekwencję pacjenta pokazano bezpośrednio poniżej, wskazując na obecność miejsc oznaczonych sekwencją (czarne słupki) i ich brak (czarna linia); punkty przerwania usuwania występują, gdy kończą się czarne kreski. Analiza molekularna usuniętego regionu została przeprowadzona przy użyciu standardowych miejsc z oznaczoną sekwencją i specyficznych starterów (jak wskazano w Dodatkowym dodatku). Panel B pokazuje chromatogram i wyrównanie sekwencji proksymalnie i dystalnie do punktów przerwania. Dokładne położenie punktów przerwania może leżeć w dowolnym miejscu w ciągu trzech reszt tymidynowych (podkreślone).
Badanie genetyczne mikrodelecji Y przeprowadzono za pomocą multipleksowej analizy PCR, zgodnie z wytycznymi EAA-EMQN.12 Analiza DNA pochodzącego z limfocytów krwi obwodowej probanda, jego ojca i jego brata wykazała delecję w regionie AZFa ( Rysunek 2).
Aby określić, czy proband miał całkowitą lub częściową delecję AZFa, określiliśmy zakres delecji przy użyciu 17 markerów (zwanych miejscami znakowanymi sekwencją), które są mapowane w tym regionie
[przypisy: węzeł virchowa, eva clinic warszawa, leczenie chorób genetycznych ]
Powiązane tematy z artykułem: eva clinic warszawa leczenie chorób genetycznych węzeł virchowa