Sekcje ultracienkie pocięto ultramrotronem (Supernova, Reickert Jung), osadzono na miedzianych siatkach, barwiono octanem uranu i cytrynianem ołowiu, obserwowano i fotografowano przy użyciu transmisyjnego mikroskopu elektronowego (CM10, Philips). Przeanalizowaliśmy ultracienkie wycinki 300 próbek plemników. Aby ocenić częstotliwość aneuploidii, przeprowadzono hybrydyzację fluorescencyjną in situ (FISH) na jądrach spermy, według Baccetti i wsp. 11. Ogółem 2880 plemników analizowano przy użyciu mieszaniny satelitarnych sond DNA (CEP, Vysis) dla chromosomów 18 X i Y, z których każdy jest bezpośrednio oznaczony różnymi fluorochromami.
Analizy molekularne
Genomowy DNA wyizolowano z limfocytów krwi obwodowej lub plemników przy użyciu dostępnego w handlu zestawu do ekstrakcji, zgodnie z protokołem producenta. Badania przesiewowe pod kątem delecji przeprowadzono początkowo dla AZFa, AZFb i AZFc, zgodnie z wytycznymi European Academy of Andrology-European Molecular Genetics Quality Network (EAA-EMQN). 12 W celu określenia zakresu delecji użyto kilku oznaczonych sekwencji miejsca (sY82, sY88, sY83, G64723, AZFa-prox2, G66179, G66183, SHGC-3904, G65852, G49201, G65840, G66201, G49206, G66189, sY87, GY6 i G38346) i swoiste dla genu startery do lokalizacji punktów przerwania do przedziału obejmującego mniej niż kb (patrz Dodatek dodatkowy, dostępny wraz z pełnym tekstem tego artykułu na stronie).
Testy reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR) przeprowadzono stosując U polimerazy Taq z buforem dostawcy, 200 uM każdego trójfosforanu deoksyrybonukleotydu i 0,3 mM każdego startera, w końcowej objętości 20 ul. Warunki termocyklingu były następujące: 30 sekund w 95 ° C, 30 sekund w 57 do 59 ° C i 45 sekund w 72 ° C, w sumie 35 cykli. Wszystkie testy PCR przeprowadzono na DNA pochodzącym od kobiety jako kontroli negatywnej, a DNA od płodnego samca jako kontroli pozytywnej. Wyniki uznano za negatywne dopiero po trzech kolejnych niepowodzeniach amplifikacji; okazjonalnie eksperymenty powtarzano na DNA wyekstrahowanym z drugiej próbki krwi pobranej od pacjenta i jego brata i ojca. Konkretne startery były również stosowane do amplifikacji USP9Y, ekson (numer dostępu w GenBank, G64987) i ekson 46 (numer dostępu w GenBank, G34983) i DDX3Y, ekson (numer dostępu w GenBank, G38346) i ekson 17 (numer dostępu w GenBank, G65240 ). W celu analizy Y-haplotypu probanda, markery głębokiego zakorzeniania SRY-1532, M9, YAP, 12f2, M231 i 92R7 były typowane za pomocą amplifikacji PCR i analizy sekwencji DNA.13,14
Analiza ekspresji genu DDX3Y
Testowano ekspresję DDX3Y w limfocytach pacjenta za pomocą dostępnego w handlu zestawu, zgodnie z protokołem producenta. Próbkę krwi od mężczyzny z prawidłową spermatogenezą zastosowano jako kontrolę pozytywną, a jedną z kobiet stosowano jako kontrolę negatywną. Dla każdej próbki syntetyzowano pierwszą nić komplementarny DNA z całkowitego RNA (uprzednio traktowanego DNazą wolną od RN-a RQ1 [Promega] w celu usunięcia zanieczyszczającego DNA), z użyciem startera wstecznego 5 -CTCGCTGTACTTGCTCCTCC-3 (celowanie w ekson 2 ). Transkrypty DDX3Y amplifikowano techniką PCR z tym samym starterem do reakcji do tyłu i starterem 5 -AGTTCCGCTATTCGGTCTCA-3 (targetowanie egzonu)
[podobne: co to zdrowie, klinika plastyczna warszawa, eva clinic warszawa ]
Powiązane tematy z artykułem: co to zdrowie eva clinic warszawa klinika plastyczna warszawa